Ich arbeite mit HepG2-Zellen und sie bilden sehr gerne Klumpen. Das Auf- und Abpipettieren in TrypLE scheint nicht sehr effektiv zu sein, um sie aufzubrechen.
Ich finde, dass ich nur dann Klumpen bekomme (mit HeLa und ähnlichen Zelltypen), wenn ich sie zu lange in Tryple lasse. Im Allgemeinen lasse ich sie bei Raumtemperatur (nicht heiß) Tryple für ~ 8 Minuten, dann winkel ich die Schüssel mit geschlossenem Deckel, damit ich den "Glanz" der Zellen auf der Schüssel sehen kann (dies geschieht natürlich in der Haube ). Dann sprenge ich den Glanz mit Tryple mit einem 1000ul Pipetter, der die Zellen entklebt. Diese sind im Allgemeinen viel weniger verklumpt, als wenn ich den Tryple die Zellen entkleben lasse.
In einigen Protokollen zum Aufbau von Primärkulturen (z. B. aus Knochenmark von Mäusen oder Rattenendometrium) gibt es einen Schritt, bei dem die Zellsuspension durch eine große Nadel gedrückt werden muss, um Klumpen zu entfernen. Dies birgt natürlich ein hohes Risiko, die Zellen zu beschädigen. Daher wird manchmal stattdessen Kollagenase verwendet.
Es kann auch hilfreich sein, Ihre Zellen vor der Passage mit PBS ohne Ionen zu waschen und Tripsin mit EDTA zu verwenden. Dadurch sollte mindestens etwas Kalzium von der Platte entfernt werden, damit die Wirkung von Adhäsionsproteinen gehemmt wird.
Zellklumpen, die nicht mit rigorosem Pipettieren dissoziieren, können sehr wohl durch freie DNA in Ihrer Zellsuspension verursacht werden (d. h. wenn Sie zu lange trypsiniert haben). Freie DNA zieht Zellen an, die sich insgesamt unter Bildung von Klumpen binden.
Zwei Möglichkeiten, diese Klumpen zu entfernen:
Sie können jederzeit zurückgehen und eine frische Ampulle der gewünschten Zelllinie kaufen :)