Frage:
Was bestimmt eine erfolgreiche Proteinexpression in E. coli?
Gergana Vandova
2011-12-17 01:54:43 UTC
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Einige Proteine ​​exprimieren gut in einem heterologen Wirt. andere - nicht. Es sind einige Anforderungen bekannt, um die Proteinexpression zu bestimmen, wie ein starker Promotor (wie T7) für die Transkription und eine starke Ribosomenbindungsstelle für die Translation. Ich arbeite mit einem Protein, das aus 2 Untereinheiten besteht - Alpha und Beta. Beide befinden sich auf einem Plasmid mit T7-Promotor vor der Beta-Untereinheit (d. H. Das Konstrukt ist T7-Promotor, CDS für die Beta-Untereinheit, CDS für die Alpha-Untereinheit). Die Beta-Untereinheit drückt sich gut aus, die Alpha jedoch nicht. Hat das etwas mit der lokalen Umgebung zu tun (Promotoren, RBSs usw.) und wie sehr hängt es davon ab? Wie kann ich die Proteinexpression erhöhen?

Einige Aspekte sind mir nicht ganz klar. Die zwei Untereinheiten werden auf getrennten Plasmiden exprimiert, oder? Und alles in den Plasmiden ist bis auf die eigentliche Proteinsequenz gleich?
Die beiden Untereinheiten befinden sich auf demselben Plasmid. Die Plasmidsequenz beginnt mit T7-Promotor, RBS1, Untereinheit Beta, RBS2, Untereinheit Alpha. Die RBS-Sequenzen sind etwas unterschiedlich, daher habe ich darüber nachgedacht, sie gleich zu machen, aber dies sollte keinen großen Einfluss auf die Proteinexpression haben. (Sie sind sehr nahe an der Konsensussequenz).
Vier antworten:
#1
+9
Mad Scientist
2011-12-17 02:31:16 UTC
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Ein wichtiger Aspekt bei der Expression eines Proteins aus einem anderen Organismus in E. coli ist, dass sich die Codonverwendung des ursprünglichen Organismus wahrscheinlich von der Codonverwendung der zur Expression verwendeten E. coli unterscheidet ( Codon Usage Bias ).

Obwohl der genetische Code entartet ist, sind nicht alle Codons gleich. Sie könnten für dieselbe Aminosäure kodieren, aber Organismen tendieren dazu, bestimmte Codons gegenüber anderen zu bevorzugen, und die tRNAs für diese Codons sind tendenziell in unterschiedlichen Konzentrationen vorhanden. Wenn Sie jetzt viele Codons in Ihrer Sequenz haben, die in E. coli sehr selten sind, leidet die Expression, weil die tRNA für diese Codons nicht in ausreichend hohen Konzentrationen vorhanden ist, um die Translation aufrechtzuerhalten.

Dort Es gibt zwei Möglichkeiten, dies zu kompensieren: Entweder bringen Sie Ihre E. coli dazu, mehr der seltenen tRNAs zu produzieren, oder Sie optimieren Ihre Sequenz, um verschiedene Codons zu verwenden. Für die erste Lösung können Sie bestimmte E. coli-Stämme kaufen, die Plasmide enthalten, die die in E. coli seltenen tRNAs codieren. Einer dieser Stämme ist z. die Rosetta BL21 Sorte.

Zur Optimierung der Codonverwendung bieten mehrere Unternehmen die Synthese optimierter Sequenzen an. Es gibt auch Tools, die online verfügbar sind, aber ich habe keine direkten Erfahrungen damit.

Die Optimierung ist auch nicht so einfach wie die Verwendung des am häufigsten verwendeten Codons jedes Mal. Es hat sich gezeigt, dass die Optimierung der Codons übereinstimmt Die Translationsgeschwindigkeit im ursprünglichen Organismus kann die Expressionsausbeuten verbessern. Bei einigen Proteinen können Pausenstellen während der Translation erforderlich sein, um eine ordnungsgemäße Faltung sicherzustellen. Wenn sich das Protein nicht richtig faltet, wird es schnell abgebaut und Ihre Ausbeute leidet. Dies ist in dem Artikel "Heterologe Proteinexpression wird durch Harmonisierung der Codonverwendungshäufigkeiten des Zielgens mit denen des Expressionswirts verbessert" von Angov et al.

beschrieben

Eine schöne Übersicht über das gesamte Thema finden Sie im Artikel "Sie sind einer in einem Googol: Optimierung der Gene für die Proteinexpression" von Welsh et al.

Danke, verrückter Wissenschaftler! Ja, ich habe über Codon-Optimierung nachgedacht und dies steht definitiv auf meiner To-Do-Liste. Entschuldigung, ich habe vergessen, es zu erwähnen. DNA 2.0 verfügt über eine Software, die Ihre Sequenz in eine optimierte umwandelt. Ich habe auch von Rosetta BL21 gehört, aber ich habe es nie benutzt. Wir möchten vielleicht auch an unserem eigenen Stamm festhalten, weil er der heterologe Produzent von oder das Medikament von Interesse ist. Ich bin ein wenig besorgt über die Codonoptimierung, gerade wegen Fehlfaltung, aber ich denke, wir sollten es tun.
Dies erklärt jedoch immer noch nicht, warum die andere Untereinheit besser exprimiert und andere Proteine ​​desselben nativen Organismus in E. coli gut exprimiert werden. Aus diesem Grund denke ich, dass es eher um die Kontrollelemente der Transkription und Translation als um die seltene Verwendung von Codons geht.
@GerganaVandova Sie sollten die Codonverwendung Ihrer beiden Untereinheiten vergleichen. Möglicherweise verwendet eines zufällig mehr seltene Codons als das andere.
Ich nehme an einem Vortrag von Claes Gustafsson aus DNA2.0 teil - und ich denke, das wussten wir bereits -, dass die Verwendung von Codons hilfreich ist, aber nicht immer funktioniert. Sie haben eine proprietäre Methode, die zuverlässiger ist ...
#2
+6
Amy
2011-12-22 05:41:32 UTC
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Haben Sie versucht, Ihre beiden Gene auf zwei separate Plasmide zu setzen (natürlich mit unterschiedlichen Replikationsursprüngen und Antibiotika-Selektionen) und auf diese Weise zu coexprimieren? Wenn die erste der beiden Untereinheiten gut exprimiert und die zweite nicht, liegt dies wahrscheinlich daran, dass die Ribosomen von der mRNA abfallen, bevor das zweite Gen vollständig transkribiert wird. Sind die Gene eukaryotischen Ursprungs? Ich denke, es ist schwierig, E. coli-Ribosomen dazu zu bringen, heterologe Sequenzen als Operon zu behandeln, aber vielleicht könnte jemand mit mehr Wissen über prokaryotische Translation helfen.

Eigentlich nur einen zweiten T7-Promotor vor sich hinzufügen von Gen 2 würde wahrscheinlich einiges helfen:

Gene werden entweder von einzelnen Promotoren oder von einem einzelnen Promotor transkribiert, was zu einer langen polycistronischen mRNA führt. Es wurde berichtet, dass die polycistronische Expression zu einer geringeren Expression des stromabwärts kodierten Proteins führt, was genutzt werden kann, um die Stöchiometrie eines Proteinkomplexes zu beeinflussen (9). Es wurde über eine mehrfach höhere Expression mit einzelnen Promotoren im Vergleich zur polycistronischen Transkription berichtet (10). ( Quelle)

Ich weiß aus eigener Erfahrung, dass die Koexpression mit zwei Plasmiden sehr gut mit den richtigen Genen funktionieren kann!

Danke für deine Antwort. Ich mag die Idee, zusätzlichen T7-Promotor hinzuzufügen, obwohl sich wiederholende Sequenzen zu anderen zukünftigen Problemen führen könnten (ich möchte nicht auf Details eingehen). Aber ich arbeite mit Genen, die dreimal so groß sind und ein Promotor für die beiden Untereinheiten funktioniert gut. Vielleicht ist es sehr sequenzspezifisch.
#3
+2
Nick T
2011-12-17 11:19:41 UTC
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Mad Scientist behandelte potenzielle Codon-Bias-Probleme (die mit Rosettas verbessert werden können), aber allgemeiner habe ich ohne ersichtlichen Grund eine enorme Variabilität der Expressionsraten zwischen verschiedenen Vektoren (pET-28 gegenüber pET-24) festgestellt. Unser Labor hatte enormen Erfolg mit IPTG-induzierbaren Vektoren (von pBC-SK zu pET-24 erhöhte Expression um das 50-fache).

Über die Expression hinaus kann das Protein bei der Herstellung des zellfreien Extrakts verloren gehen. Es befindet sich möglicherweise nicht im Zellpellet, wenn es mit freundlicher Genehmigung eines Signalpeptids exportiert wird, oder es kann im "Trümmer" -Pellet verworfen werden, wenn lysierte Zellen heruntergeschleudert werden, wenn es schlecht löslich ist. Ich habe eine Theorie gehört, dass Löslichkeitsprobleme durch Vektoren, die die Exportmaschinerie sättigen, übertrieben werden können, was sowohl die Synthese behindern als auch so effektiv sein kann, dass sie nur Niederschlag verursachen. Das pET-Systemhandbuch schlägt vor, dass längere Expressionszeiten (über Nacht) bei niedrigeren (15-20 ° C) Löslichkeitsproblemen helfen können. Was auch immer der Grund sein mag, das Wegentwickeln des Signalpeptids erhöhte die Expression für viele unserer Proteine ​​drastisch.

#4
+2
Gergana Vandova
2012-01-07 01:15:01 UTC
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Ich habe ein sehr schönes Papier gefunden: Entwerfen von Genen für eine erfolgreiche Proteinexpression, das die meisten Faktoren abdeckt, die die Proteinexpression bestimmen. Ich poste Teile davon, weil ich sicher bin, dass es für einige von Ihnen nützlich sein wird.

Die Übersetzung kann auf der Ebene der Initiierung und Verlängerung gesteuert werden. Der Beginn der Translation hängt hauptsächlich von der Sequenz der Ribosomenbindungsstelle (RBS) und der frühen mRNA-Sekundärstruktur ab. Andere Determinanten der Proteinexpression sind weniger gut verstanden, aber gleichermaßen wirksam.

1. Initiierung der Translation

Eine Schlüsselkomponente, die die Initiierung der Translation in Prokaryoten beeinflusst, ist die RBS , die zwischen 5 und 15 Basen vor dem AUG mit offenem Leserahmen (ORF) auftritt Codon starten. Die Bindung des Ribosoms an die Shine-Dalgarno (SD) -Sequenz innerhalb des RBS lokalisiert das Ribosom an das Initiationscodon ... Die Affinität des RBS zum Ribosom ist ein kritischer Faktor, der die Effizienz steuert, mit der neue Polypeptidketten werden initiiert. Diese Wechselwirkung steht im Wettbewerb mit möglichen Basenpaarungswechselwirkungen, an denen die RBS-Region beteiligt ist, die sich innerhalb der mRNA selbst bilden können. Somit sind SD-Sequenzen mit einer schwächeren Basenpaarung an das Ribosom anfälliger für Interferenzen durch die mRNA-Struktur. Einige Experimente legen jedoch nahe, dass SD-Sequenzen mit zu starker Affinität schädlich sein können, insbesondere bei niedrigeren Temperaturen, indem die anfängliche Dehnung blockiert wird. Kritisch ist auch der Abstand zwischen dem RBS und dem Startcodon, wobei 5-7 Basen vom Konsensus-SD-AGGAGG optimal sind

Zahlreiche Hinweise deuten darauf hin, dass die anfänglichen 15–25 Codons des ORF bei der Genoptimierung besondere Berücksichtigung verdienen. Studien haben gezeigt, dass der Einfluss seltener Codons auf die Translationsrate in diesen ersten Codons für die Expression sowohl in Escherichia coli als auch in Saccharomyces cerevisiae besonders stark ist. In E. coli scheint der Peptidyl-tRNA-Abfall während der Translation der anfänglichen Codons durch das Vorhandensein seltener NGG-Codons akzentuiert zu sein. Diese Effekte scheinen unabhängig von der lokalen mRNA-Sekundärstruktur zu sein. Es ist auch wahr, dass die Expression durch 5'-Sequenzersatz wiederhergestellt werden kann, selbst für Sequenzen, die keine besonders starke mRNA-Struktur zeigen oder seltene Codons oder andere offensichtliche schädliche Elemente in dieser Region enthalten.

2. Codon Bias

Die zweite Möglichkeit, Wirtscodonfrequenzen zu verwenden, besteht darin, die Wirtscodonfrequenzen im entworfenen Gen abzugleichen. Dies kann einfach durch Auswahl jedes Codons mit einer Wahrscheinlichkeit erfolgen, die der Häufigkeit des Wirtscodons entspricht ... Unter Verwendung von Gengruppen, die sich in ihren Gendesignmerkmalen stark unterscheiden, haben Welch et al. fanden heraus, dass die Variation der Häufigkeit der Codonverwendung einen tiefgreifenden Einfluss auf die in E. coli produzierte Proteinmenge hatte, unabhängig von lokalen 5'-Sequenzeffekten. Eine Variation von mindestens zwei Größenordnungen in der Expression wurde aufgrund einer Substitution über die anfänglichen 15 Codons des ORF hinaus beobachtet. Diese Variation korrelierte stark mit den globalen Codonverwendungshäufigkeiten der Gene, obwohl die Codonfrequenzen, die in den am höchsten exprimierten Varianten gefunden wurden, nicht denen entsprachen, die im Genom oder in hoch exprimierten endogenen Genen von E. coli gefunden wurden. Eine multivariate Analyse zeigte, dass die Häufigkeit spezifischer Codons für etwa sechs Aminosäuren die beobachteten Expressionsunterschiede vorhersagen konnte. Es ist nicht klar, auf welcher biochemischen Grundlage diese Korrelation beruht.

3. mRNA-Struktur und Translationsverlängerung

Während viele Hinweise darauf hinweisen, dass die mRNA-Struktur die Translationsinitiierung sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten stören kann, sind die Auswirkungen der Struktur auf die Verlängerung weniger gut bekannt. Dies kann teilweise auf die intrinsische Helikase-Aktivität von Ribosomen zurückzuführen sein, die die Translation durch selbst sehr starke Haarnadeln ermöglicht und viele Strukturen daran hindern kann, die Translationsrate in Prokaryoten oder Eukaryoten zu begrenzen. Vielleicht noch wichtiger ist, dass die mRNA-Struktur schwer vorherzusagen ist, insbesondere für aktiv übersetzte Nachrichten, die sich im kontinuierlichen Fluss zwischen verschiedenen gefalteten und ungefalteten Zuständen befinden.

4. Proteinspezifische Faktoren, die zusätzliche Komplexität bieten

Das Protein kann im Wirt besonders instabil sein, insbesondere wenn es aufgrund von inhärenter Instabilität, Mangel an ausreichenden prothetischen Faktoren oder falscher posttranslationaler Funktion schlecht gefaltet ist Modifikation ... Die Expression von sekretierten Proteinen und Membranproteinen kann durch Mechanismen zur Leitung dieser Proteine ​​zur Membran begrenzt sein. Es ist sogar möglich, dass die Proteinaminosäuresequenz die Translationseffizienz einschränkt. Beispielsweise wird angenommen, dass Prolin in E. coli langsam translatiert wird, unabhängig davon, welches Codon verwendet wird. Die Expression des Proteins kann für die Zelle toxisch sein, was zu einer Instabilität von führt Der Expressionsvektor oder die Wirtsunterdrückung der Proteinsynthese ... Eine übliche Strategie zur Verringerung der Toxizität besteht darin, die Expression auf tolerierbare Werte zu senken. Promotoren mit unterschiedlicher Stärke können wertvolle Werkzeuge sein, um eine optimale Expressionsrate für maximale Ausbeute zu finden ... Ein möglicher Weg, um die Toxizität einiger Proteine ​​zu vermeiden, besteht darin, die Expression auf das Periplasma oder die Medien zu lenken. Dies kann durch N-terminale Fusion einer Sekretionssignalsequenz erreicht werden.

Weitere Informationen finden Sie im gesamten Artikel. Ich empfehle auch, Designparameter zu lesen, um die synthetische Genexpression in Escherichia coli zu kontrollieren.

Danke für die Links! Ich habe DNA 2.0 bereits für die Codonoptimierung und Gensynthese verwendet und gute Ergebnisse erzielt. Ich bin definitiv daran interessiert, ihre Veröffentlichungen zu lesen.
@Amy: Ja, ein Teil des Papiers befasst sich mit den Funktionen von DNA2.0, die ich sehr nützlich finde. Ich bin ein neuer Benutzer und gewöhne mich immer noch an ihre Software, aber sie sieht bisher ziemlich gut aus.


Diese Fragen und Antworten wurden automatisch aus der englischen Sprache übersetzt.Der ursprüngliche Inhalt ist auf stackexchange verfügbar. Wir danken ihm für die cc by-sa 3.0-Lizenz, unter der er vertrieben wird.
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