Frage:
Wie kann ich die Verdauung von proteingebundener DNA vermeiden?
Daniel Standage
2011-12-15 03:23:42 UTC
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Ich bin daran interessiert, die gebundene DNA zu sequenzieren und zu analysieren und die Menge an ungebundener DNA zu minimieren, die durch Verdauung sequenziert wird.

Beim Verdauen von proteingebundener DNA ist all der ungebundenen verdauten DNA? Gibt es eine Möglichkeit, die Menge an ungebundener DNA, die verdaut wird, zu maximieren?

Vier antworten:
#1
+4
agrimaldi
2011-12-15 05:17:06 UTC
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Nun, es hängt davon ab, ob Sie nur Ihre proteingebundenen Fragmente sequenzieren möchten. Wenn dies der Fall ist, könnten Sie sich für eine FAIRE-Sequenz entscheiden. Grundsätzlich führen Sie mehrere iterative Phenol / Chlo-Extraktionen durch und trennen so die gebundenen und ungebundene Fragmente. Dann sequenzieren Sie die ungebundenen Fragmente, die in der wässrigen Phase vorhanden sind, und nach der Kartierung können Sie die Regionen ableiten, die tatsächlich an Proteine ​​gebunden waren.

Ich weiß nicht, ob dies der Fall ist Es ist möglich, Ihre gebundenen Fragmente (die Sie nach einer Phenol / Chlo-Extraktion in der organischen Phase isolieren) mit Proteinase K zu behandeln. Führen Sie dann eine weitere Phenol / Chlo-Extraktion durch, um Ihre zuvor gebundenen Fragmente zu reinigen und zu sequenzieren. Könnte einen Versuch wert sein.

#2
+3
Sam Cotton
2012-02-25 13:50:59 UTC
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Interessieren Sie sich für die Bindung von Transkriptionsfaktoren (und ähnliche) oder für Histonmodifikationen?

Wenn Sie etwas mit einem kurzen Bindungsmotiv untersuchen möchten, das redundant im gesamten Genom auftritt, funktioniert ChIP-exo : http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(11)01351-1

Bei dieser Technik wird ein DNA-Strang bis zum gebundenen Protein verdaut -DNA-Komplex über Exonuklease, wobei am anderen Ende genügend Markierungen verbleiben, um die Position innerhalb des Genoms eindeutig zu identifizieren. Ich habe keine Erfahrung aus erster Hand damit und es muss noch unabhängig repliziert werden, aber es sieht fantastisch aus. Ich erinnere mich nicht, ob sie untersucht haben, inwieweit Off-Target-DNA durch die Exonuklease verdaut wurde, aber theoretisch gehe ich davon aus, dass ein erheblicher Teil aufgefressen worden wäre.

Wenn Sie an ChIP von Histon interessiert sind Modifikationen können Sie Mikrokokken-Nuklease (MNase) für Ihre Probenvorbereitung anstelle von Ultraschall verwenden. Auch hier habe ich keine Erfahrungen aus erster Hand, aber ich verstehe, dass dieses Enzym verwendet werden kann, um DNA zu verdauen, bis es das nukleosomale Kernteilchen erreicht, und es gibt veröffentlichte ChIP-seq-Experimente, die diese Strategie anwenden. Es wird erwartet, dass die MNase ungebundene DNA-Fragmente verdaut

#3
+1
shigeta
2012-02-25 11:59:34 UTC
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Dies ist ein schwieriges Experiment. Dies geschieht normalerweise durch Verdauung der DNA unter Bedingungen, unter denen das Bindungsprotein fest gebunden ist. DNAse wird zugegeben, und nach einiger Zeit wird die DNAse durch Hitze oder die Zugabe eines Inhibitors abgebaut.

Was Sie erhalten, hängt von der Länge der durch das Protein geschützten DNA und der Zähigkeit ab, mit der sich das Protein an die DNA bindet.

#4
+1
user560
2012-02-29 05:30:41 UTC
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Wenn Sie herausfinden möchten, welche Nukleoside vom Protein spezifisch erkannt werden, müssen Sie nach dem Eingrenzen der Sequenz mit einer der oben genannten Methoden aufeinanderfolgende Mutageneserunden durchführen.



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