Frage:
Was ist ein gutes Miniprep-Protokoll für das Klassenzimmer?
shigeta
2011-12-15 04:39:07 UTC
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Ich versuche ein gutes Protokoll für Plasmid-Minipreps zu finden und schaue mir 3 Präparate an, die ich gefunden habe:

  1. Verwenden von Phenol / Chloroform
    • Extrakt mit Phenol: Chloroform: Isoamylalkohol,
    • Isopropanolfällung, 12.000 g Schleudern,
    • Spülen mit kaltem 70% igem Ethanol.
    /
  2. Verwenden von Lysozym
    • Mit Lysozym lysieren,
    • Pellet entfernen,
    • Isopropanolfällung,
    • mit kaltem 80% igem Ethanol waschen.
  3. Mit alkalischer Lyse
    • öffnen Zellen mit 80% Glucose in EDTA-Puffer,
    • fügen SDS und NaOH hinzu,
    • Pelletprotein / Membran mit Essigsäure / Acetat,
    • Ispropanolfällung,
    • mit kaltem 70% igem Ethanol waschen.
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    Sie unterscheiden sich alle darin, wie die Zellen aufgebrochen und Plasmide vom Rest der Zelle getrennt werden - ziemlich viel. Kann mir jemand helfen, herauszufinden, welches Protokoll hier am besten ist?

Sind Sie sicher, dass die Schüler Phenol verwenden sollen? Die meisten Labore verwenden wahrscheinlich Kits für die DNA-Extraktion (z. B. Quiagen MiniPrep). Es ist viel einfacher und auch sicherer.
Ich werde Revens Antwort als die beste markieren, da sie mir bei der Auswahl der Protokolle am meisten hilft. aber danke, dass du darauf hingewiesen hast, wie billig die Qiagen-Kits sind - ich hätte gedacht, dass sie viel schlimmer sind. Sie lernen etwas mithilfe eines Protokolls, aber die Spalten sind einfach!
Zu Ihrer Information: Für Spin-Säulen sind es zwar ungefähr 1 bis 2 US-Dollar pro Pre, aber die Reagenzienkosten für SDS / NaOH betragen ungefähr 40 Cent pro Prep. Sie müssen jedoch über 100 Vorbereitungen treffen, um die Einsparungen zu sehen.
Ich wollte nur aktualisieren, dass ich Kolumnen von Biobasic gekauft habe, und obwohl es nicht so für den Unterricht ist wie diese grundlegenden Protokolle, sind sie sicherlich billig genug und sollten für den Unterricht in Betracht gezogen werden - Upvotes rundum.
@MadScientist Spin-Säulen sind in der Tat die häufigste Option, aber es gibt einen pädagogischen Aspekt: ​​Es gibt nicht viel zu lernen, wie man einem Kit-Handbuch folgt, aber eine PCI-Extraktion lehrt einige wichtige Biochemie. Selbst wenn routinemäßige Reinigungen mit Spin-Säulen durchgeführt werden, kann PCI ein wertvoller Rückfall sein, wenn Sie zufällig stecken bleiben, weil immer wieder Verunreinigungen durch Ihre Säule gelangen.
Am Ende habe ich darüber gesprochen, was jeder Schritt der Spinvorbereitung macht und es funktioniert gut. Die alten Methoden sind nicht viel strenger, wenn Sie über die pH-Änderung der Affinität zu Kieselsäure usw. sprechen
Fünf antworten:
#1
+7
Nick T
2011-12-15 05:09:02 UTC
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Das Protokoll, das ich in meinem Genetik-Praktikum verwendet habe, war die alkalische Lyse, gefolgt von einer Ethanolfällung ähnlich dieser. Nichts, was furchtbar giftig ist oder einen Abzug erfordert (zumindest bei den verwendeten kleinen Mengen).

Die praktischere und zuverlässigere Methode ist die Verwendung eines Miniprep-Kits (normalerweise Spin-Säulen) von einem von mehreren Lieferanten ( Qiagen, Promega, Bio-Rad usw.), die mit 1-2 USD pro Zubereitung ziemlich erschwinglich sind.

Wenn ich mich richtig erinnere, ist die alkalische Lyse * die zugrunde liegende Methode hinter den Qiagen-DNA-Reinigungskits (Miniprep usw.). Mit den Spin-Säulen aus dem Kit können Sie die Alkoholfällung und das Trocknen herausschneiden. Hört sich vielleicht nicht nach viel an, aber es ist den Preis des Kits wert, da es mehr als 10 Minuten und einen sensiblen Schritt aus dem Protokoll entfernt. Meine zwei Cent: Sie wollen kein Phenol im Klassenzimmer verwenden.
Alle von mir verwendeten Prep-Kits (Qiagen, Promega, Invitrogen) verwenden alkalische Lyse. Ich mag die Säulen nur, um mir keine Sorgen machen zu müssen, dass das gesamte Ethanol vollständig verdampft (ich benutze sie mit einem Vakuumverteiler, damit ich ein oder zwei Minuten länger sauge, damit alles verdunstet) oder um nach einem halb unsichtbaren Pellet zu suchen .
Wenn ich die Qiagen-Rezepte auf Open Wet Ware gefunden habe, gefällt mir das mehr. Http://openwetware.org/wiki/Miniprep/Qiagen_kit Ich fühle mich besser, wenn ich es in einer Klasse verwende.
#2
+6
yamad
2011-12-22 15:13:24 UTC
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Ich denke, die Spin Column Kits sind der richtige Weg. Wie bereits erwähnt, haben die Kits den Vorteil, dass sie einfach, sicher und (was am wichtigsten ist) sind, wie fast jedes Labor heutzutage die Plasmidreinigung durchführt.

Die größte Kritik an den kommerziellen Kits ist, dass Sie leicht auskommen können, ohne etwas darüber zu wissen, was tatsächlich in der Röhre passiert. Wie in den Kommentaren zu Nick Ts Antwort erwähnt, enthalten die Kits jedoch keine geheime proprietäre Technologie - sie verwenden die alkalische Lyse -Methode. Dies bedeutet, dass Sie den Mechanismus in der Klasse weiterhin unterrichten können, während Sie die Vorteile der Spin-Spalten nutzen.

Eine Option für Unterrichtszwecke besteht darin, alle Ihre eigenen Lösungen zu erstellen und nur die Spin-Spalten zu verwenden der Überstand nach Pelletierung der ausgefällten Membran / Protein. Auf diese Weise haben Sie den Vorteil, dass Sie auf echten Namen für die Lösungen bestehen (NaOH ist ein lehrreicher Name als P2) und die Spin-Säulen anstelle der Ethanolfällung verwenden können. Ich glaube, es gibt billige Quellen, die nur die Spin-Säulen verkaufen, obwohl ich sie nie benutzt habe. Sie möchten die Ethanolfällung vermeiden, da sie dem Protokoll mindestens 30 Minuten hinzufügt (für meine Protokolle waren es eher 1,5 Stunden oder mehr). Das Warten auf das Verdampfen von Ethanol, damit Sie es wieder resuspendieren können, ist wie das Trocknen von Farbe, es sei denn, Sie haben einen Speed ​​Vac.

Der Ertrag sollte in einer Klassensituation kein großes Problem sein, aber Sie können den Ertrag mit der Säule steigern durch Verlängerung des letzten Elutionsschritts. Ich denke, die gegebene Anweisung ist, den TE-Puffer (Tris) vor dem letzten Schleudern 1 Minute lang "eluieren" zu lassen, aber ich habe den TE routinemäßig etwa 15 bis 30 Minuten lang stehen lassen, bevor er sich dreht. Der Ertragsunterschied hat die Belichtung auf der Gelkamera ausgeblasen.

Es gibt bestimmte Fälle, in denen Phenol: Chloroform-Extraktionen immer noch wünschenswert sind, aber dies ist definitiv keine davon. Ich habe P: Cs routinemäßig gemacht, wenn ich mit genomischer RNA und Hefe-DNA gearbeitet habe. Ich habe noch nie jemanden gesehen, der etwas anderes als einen Miniprep bei der Herstellung von Plasmiden gemacht hat. Darüber hinaus ermutigten die mühsame Arbeit in einem Abzug und das Risiko von Phenolverbrennungen viele Menschen im Labor, die Spin-Kits auch bei der Arbeit mit genomischer DNA zu bevorzugen.

Nach einiger Anstrengung sind wir zu den Spin Kits übergegangen ...
#3
+4
Reven
2011-12-15 05:52:23 UTC
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Nach meiner Erfahrung erzielt die P: C: I-Methode höhere Erträge und ist etwas einfacher (in Schritten und Schritten), aber wie @Mad Scientist gesagt hat, könnte die Verwendung von Phenol ein Problem sein. Dies hängt vom Alter Ihrer Schüler ab.

Es ist nicht nur das Alter der Schüler, es hängt auch von den verfügbaren Einrichtungen ab. Sie benötigen zum Beispiel eine Haube und einen Service für die Entsorgung von Phenol.
Phenol und Chloroform sind hochgiftig und krebserregend und sollten auf keinen Fall von Schülern oder außerhalb eines geeigneten Abzugs verwendet werden.
#4
+4
user91
2011-12-15 06:47:21 UTC
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Mit Hilfe von Spin-Säulen extrahierten mein Professor und ich in wenigen Stunden ~ 30 Plasmide aus ~ 30 Proben. Es ist einfach, billig und liefert ein Plasmid von guter Qualität. Meine Probe wurde durch UV-Spezifikation quantifiziert und lag bei etwa 200 ng / ul

#5
  0
George
2014-02-01 08:25:24 UTC
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Um Kosten zu sparen, können Sie Spin-Säulen allein bei Lieferanten wie Syd Labs kaufen ( http://www.sydlabs.com/spin-column-for-plasmid-miniprep-p110.htm ) und machen hausgemachte Puffer. Die Lieferanten stellen normalerweise das Pufferrezept zur Verfügung.



Diese Fragen und Antworten wurden automatisch aus der englischen Sprache übersetzt.Der ursprüngliche Inhalt ist auf stackexchange verfügbar. Wir danken ihm für die cc by-sa 3.0-Lizenz, unter der er vertrieben wird.
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