Frage:
Was verursacht mein Problem mit sehr geringen Ausbeuten bei der Isolierung eines 42-kb-Hefeplasmids?
Gergana Vandova
2011-12-17 02:14:50 UTC
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Ich muss ein großes Plasmid aus Hefe isolieren und in E. coli transformieren. Nach der Transformation bekomme ich oft keine Kolonien. Ein Grund dafür ist, dass das Hefe-Mini-Präparat nicht funktioniert hat oder die DNA-Konzentration zu niedrig ist. Ich habe zwei verschiedene Isolierungsprotokolle ausprobiert:

  • Zymoprep I-Hefeplasmid-Vorbereitungskit

    Aus dem Dokument: "basierend auf dem alten E. . coli-alkalische Lyse-Methode mit unserer in der ersten Lösung zugesetzten Zymolyase. "

  • Phenol-Chloroform-YAC-Isolierungsprotokoll

    verwendet von Dan Gibson et. al] für ihre riesigen Konstrukte (> 100 kb)

    Sie verwenden am Ende eine teure Qiagen-Säule mit großen Konstrukten, um den Hefeextrakt auf einem Gel zu reinigen und sichtbar zu machen, aber ich überspringe diesen Schritt, weil die Die Qiagen-Säule kostet 40 US-Dollar pro Hefeklon, der nicht skaliert, wenn wir viele davon durchführen.

Wie kann ich die oben genannten Protokolle beheben und optimieren? Gibt es andere Protokolle, die für ein großes Plasmid besser geeignet sind und keine zu teuren Materialien verwenden?

Zwei antworten:
#1
+5
yamad
2011-12-22 15:40:17 UTC
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Ein zuverlässiges Protokoll für die Hefe-DNA-Extraktion, das ich verwendet habe, war den von Ihnen zitierten Protokollen weitgehend ähnlich, enthielt jedoch eine Ethanolfällung vor und nach den P: C-Extraktionen. Das einzige teure Material war Zeit. Der allgemeine Überblick war:

  1. Alkalische Lyse
  2. Ethanolfällung
  3. RNase Eine Behandlung von resuspendierter DNA für 15 Minuten
  4. Phenol : Chloroformextraktion (x2)
  5. Ethanolfällung
  6. ol>

    Sie wissen wahrscheinlich, dass die Ethanolfällungsüberlieferung besagt, dass die Ausbeute umso besser ist, je länger und kälter Sie Ihre Ethanolfällungen durchführen. Ich habe nur einige Male reverse Transkriptasereaktionen durchgeführt, aber die von mir hergestellte Matrizen-DNA verbrachte die Nacht in Ethanol bei -80 ° C, um die Ausbeute zu maximieren. Ein weiterer Ort, an dem Sie noch einmal überprüfen sollten, ist, dass Ihre Hefekulturen vor dem Start ausreichend dicht sind.

Was sollte der OD der Kultur sein? Was ist das Volumen der Kultur?
Ich habe 1,5 ml einer "dichten Übernachtkultur" für dieses Protokoll genommen. Ich erinnere mich nicht, dass ich in Bezug auf die OD besonders vorsichtig war (und die OD ist sowieso relativ belastungsabhängig). Für uns bedeutete "über Nacht", dass sich die Kultur in einer gesunden stationären Phase befand und dass dies leicht mit dem Auge beurteilt werden konnte. Wenn Sie ein Gefühl für die Wachstumseigenschaften Ihres Stammes bekommen möchten, starten Sie morgens eine Kultur und nehmen Sie den ganzen Tag über regelmäßig OD600-Messungen vor. Das sollte Ihnen ein klares Bild davon geben, wann Sie die maximale Anzahl gesunder Zellen haben.
#2
+2
Amy
2012-02-22 00:35:24 UTC
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Ich habe das Zymoprep-Kit erfolgreich verwendet, jedoch nur für kleinere Plasmide in 2-Hybrid-Experimenten. Ihr Zelllyseenzym / Puffersystem funktioniert also gut, aber ich würde vermuten, dass Ihr 42-kb-Plasmid mit der genomischen DNA ausfällt.

Die Standard-Qiagen-Midi-Säulen können große Konstrukte erfassen. Dies hat Wunder für mich gewirkt, als ich große BACmids von E. coli gereinigt habe - und die Kosten auf 10 USD / Probe gesenkt hat (es erfordert zusätzlichen Puffer, aber das ist eine geringe Ausgabe). Es könnte sich lohnen, die Qiagen-Hefe-DNA-Protokolle für das Midi-Kit auszuprobieren und zu prüfen, ob Sie Ihr großes Plasmid isolieren können?

Und für das, was es wert ist, waren die technischen Mitarbeiter von Qiagen am Telefon sehr hilfreich. Im Gegensatz zu Invitrogen. Ich fürchte jeden Anruf beim technischen Service von Invitrogen. >: [


Diese Fragen und Antworten wurden automatisch aus der englischen Sprache übersetzt.Der ursprüngliche Inhalt ist auf stackexchange verfügbar. Wir danken ihm für die cc by-sa 3.0-Lizenz, unter der er vertrieben wird.
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